МИКРОСКОП

МИКРОСКОП (от микро... и
греч skopeo - смотрю), оптический прибо] для получения сильно увеличенных
изо бражений объектов (или деталей и: структуры), невидимых невооружённыр
глазом. Человеческий глаз представляв собой естеств. оптич. систему, характе
ризующуюся определённым р а з р е ш е н и е м, т. е. наименьшим расстоя
нием между элементами наблюдаемой объекта (воспринимаемыми как точки илз
линии), при к-ром они ещё могут быт: отличены один от другого. Для нормаль
кого глаза при удалении от объекта н; т. н. расстояние наилучше го видения
(D = 250 мм) мини мальное разрешение составляет пример но 0,08 мм
(а
у мн. людей - ок. 0,20 мм). Размеры микроорганизмов, большинства
растит, и животных клеток, мелких кристаллов, деталей микроструктуры металлов
и сплавов и т. п. значительно меньше этой величины. Для наблюдения и изучения
подобных объектов и предназначены М. различных типов. С помощью М. определяют
форму, размеры, строение и мн. др. характеристики микрообъектов. М. даёт
возможность различать структуры с расстоянием между элементами до 0,20
мкм.



Историческая справка. Свойство системы
из двух линз давать увеличенные изображения предметов было известно уже
в 16 в. в Нидерландах и Сев. Италии мастерам, изготовлявшим очковые стёкла.
Имеются сведения, что ок. 1590 прибор типа М. был построен 3. Янсеном (Нидерланды).
Быстрое распространение М. и их совершенствование, гл. обр. ремесленниками-оптиками,
начинается с 1609-10, когда Г. Галилей, изучая сконструированную
им зрительную трубу, использовал её и в качестве М., изменяя расстояние
между объективом и окуляром. Первые блестящие успехи применения М. в науч.
исследованиях связаны с именами Р. Гука (ок. 1665; в частности,
он установил, что животные и растит, ткани имеют клеточное строение) и
особенно А. Левенгука, открывшего с помощью М. микроорганизмы (1673-77).
В нач. 18 в. М. появились в России; здесь Л. Эйлер (1762; "Диоптрика",
1770-71) разработал методы расчёта оптич. узлов М. В 1827 Дж. Б. Амичи
впервые
применил в М. иммерсионный объектив. В 1850 англ, оптик Г. Сорби создал
первый М. для наблюдения объектов в поляризованном свете. Широкому развитию
методов микро-скопич. исследований и совершенствованию различных типов
М. во 2-й пол. 19 и в 20 вв. в значит.степени способствовала науч. деятельность
Э. Аббе, к-рый разработал (1872-73) ставшую классической теорию
образования изображений несамосветящихся объектов в М. Англ, учёный Дж.
Сиркс в 1893 положил начало интерференционной микроскопии. В 1903 австр.
исследователи Р. Зшмонди и Г. Зидентопф создали т. н. ультрамикроскоп.
В 1935 Ф. Цернике предложил метод фазового контраста для наблюдения
в М. прозрачных слабо рассеивающих свет объектов. Большой вклад в теорию
и практику микроскопии внесли сов. учёные - Л. И. Мандельштам, Д.
С. Рождественский, А. А. Лебедев, В. П. Линник.



Оптическая схема, принцип действия,
увеличение и разрешающая способность микроскопа. Одна из типичных схем
М. приведена на рис. 1. Рассматриваемый объект (препарат) 7 располагают
на предметном стекле 10. Конденсор 6 концентрирует на объекте пучок
света, отражающегося от зеркала 4. Источником света в М. чаще всего
служит спец. осветитель, состоящий из лампы и линзы-коллектора (соответственно
/ и 2 на рис.); иногда зеркало направляет на объект обычный дневной
свет. Диафрагмы - полевая 3 и апертурная 5 ограничивают
световой пучок и уменьшают в нём долю рассеянного света, попадающего па
препарат "со стороны" и не участвующего в формировании изображения.

Возникновение изображения препарата в М.
в основных (хотя и наиболее простых) чертах можно описать в рамках геометрической
оптики. Лучи света, исходящие от объекта 7, преломляясь в объективе
8, создают перевёрнутое и увеличенное действительное изображение
оптическое Т объекта. Это изображение рассматривают через окуляр
9. При визуальном наблюдении М. фокусируют так, чтобы 7' находилось
непосредственно за передним фокусом окуляра Fок. В этих условиях окуляр
работает как лупа: давая дополнит, увеличение, он образует мнимое
изображение 7" (по-прежнему перевёрнутое); проходя через оптич. среды глаза
наблюдателя, лучи от 7" создают на сетчатке глаза действит. изображение
объекта. Обычно 7" располагается на расстоянии наилучшего видения D
от
глаза. Если сдвинуть окуляр так, чтобы Т оказалось перед
Fто изображение, даваемое окуляром, становится действительным и его
можно получить на экране или фотоплёнке; по такой схеме производят, в частности,
фото- и киносъёмку микроскопич. объектов (см. Микропроекция).

Общее увеличение М. равно произведению
линейного увеличения объектива

берется в мм). Обычно объективы
М. имеют увеличения от 6,3 до 100, а окуляры - от 7 до 15 (их значения
гравируются на оправах). Поэтому общее увеличение М. лежит в пределах от
44 до 1500.

Разумеется, технически возможно применить
в М. объективы и окуляры, к-рые дадут общее увеличение, значительно превышающее
1500. Однако обычно это нецелесообразно. Большие увеличения не являются
самоцелью - назначение М. состоит в том, чтобы обеспечить различение как
можно более мелких элементов структуры препарата, т. е. в максимальном
использовании разрешающей способности М. А она имеет предел, обусловленный
волновыми свойствами света. (В геометрич. оптике, в рамках к-рой выше было
рассмотрено образование изображения в М., отвлекаются от этих свойств света,
но предел возможностей М. определяют именно они.) Согласно общей закономерности,
наблюдая объект в к.-л. излучении с длиной волны X, невозможно различить
элементы объекта, разделённые расстояниями, намного меньшими, чем X. Эта
закономерность проявляется и в М., причём количеств, её выражение несколько
различно для самосветящихся и несамосветящихся объектов. Изображение испускающей
монохроматический свет точки, даваемое даже идеальным (не вносящим никаких
искажений) объективом, не воспринимается глазом как точка, так как вследствие
дифракции
света фактически является круглым светлым пятнышком конечного диаметра
d, окружённым неск. попеременно тёмными и светлыми кольцами (т. н. дифракционное
пятно,

ния среды, разделяющей светящуюся точку
и объектив, иполовина угла раствора светового пучка,
исходящего из точки и попадающего в объектив). Если две светящиеся точки
расположены близко друг от друга, их дифракционные картины накладываются
одна на другую, давая в плоскости изображения сложное распределение освещённости
(рис. 2). Наименьшая относит, разница освещённостей, к-рая может быть замечена
глазом, равна 4%. Этому соответствует наименьшее расстояние

Рис. 2. Распределение освещённостей в изображении
двух близких "точек" в предельном случае их визуального разрешения.

апертуры ооъектива и конденсора м. (значения
апертур гравируются на оправах).

Изображение любого объекта состоит из совокупности
изображений отд. элементов его структуры. Мельчайшие из них воспринимаются
как точки, и к ним полностью применимы ограничения, следующие из дифракции
света в М.- при расстояниях между ними, меньших предельного разрешения
М., они сливаются и не могут наблюдаться раздельно. Существенно повысить
разрешающую способность М. можно, только увеличивая Л. В свою очередь,
увеличить А можно лишь за счёт повышения показателя преломления
и среды между объектом и объективом (т. к. sin и=5
1). Это и осуществлено в иммерсионных системах, числовые апертуры
к-рых достигают величины А = 1,3 (у обычных "сухих" объективов макс.
А
" 0,9).

Существование предела разрешающей способности
влияет на выбор увеличений, получаемых с помощью М. Увеличения от 500 А
до
1000 А наз. полезными, т. к. при них глаз наблюдателя различает
все элементы структуры объекта, разрешаемые М. При этом исчерпываются возможности
М. по разрешающей способности. При увеличениях св. 1000 А не выявляются
никакие новые подробности структуры препарата; всё же иногда такие увеличения
используют - в микрофотографии, при проектировании изображений на экран
и в нек-рых др. случаях. Существенно более высокими, чем у М., разрешающей
способностью и, следовательно, полезным увеличением обладает электронный
микроскоп.



Методы освещения и наблюдения (микроскопия).
Структуру
препарата можно различить лишь тогда, когда разные его частицы по-разному
поглощают или отражают свет либо отличаются одна от другой (или от окружающей
среды) показателем преломления. Эти свойства обусловливают разницу амплитуд
и фаз световых волн, прошедших через различные участки препарата, от чего,
в свою очередь, зависит контрастность изображения. Поэтому методы наблюдения
в М. выбираются (и обеспечиваются конструктивно) в зависимости от характера
и свойств изучаемых объектов.

Метод светлого поля в проходящем свете
применяется при исследовании прозрачных препаратов с включёнными в них
абсорбирующими (поглощающими свет) частицами и деталями. Таковы, напр.,
тонкие окрашенные срезы животных и растит, тканей, тонкие шлифы минералов
и т. д. В отсутствие препарата пучок света из конденсора 6 (рис.
1), проходя через объектив 8, даёт вблизи фокальной плоскости окуляра
9
равномерно освещённое поле. Если в препарате 7 имеется абсорбирующий
элемент, то он отчасти поглощает и отчасти рассеивает падающий на него
свет (штриховая линия), что и обусловливает появление изображения. Метод
может быть полезен и при наблюдении неабсорбирующих объектов, но лишь в
том случае, если они рассеивают освещающий пучок настолько сильно, что
значит, часть его не попадает в объектив.

Метод косого освещения является разновидностью
предыдущего, отличаясь тем, что свет на объект направляют под большим углом
к направлению наблюдения. В ряде случаев это позволяет выявить -"рельефность"
объекта за счёт образования теней.

Метод светлого поля в отражённом свете
(рис. 3) применяется для наблюдения непрозрачных отражающих свет объектов,
напр, шлифов металлов или руд. Освещение препарата 4 (от осветителя
/ и полупрозрачного зеркала 2) производится сверху, через объектив
3,
к-рый одновременно играет и роль конденсора. В изображении, создаваемом
в плоскости 6 объективом совместно с тубусной линзой 5, структура
препарата видна из-за различия в отражающей способности её элементов; на
светлом поле выделяются также неоднородности, рассеивающие падающий на
них свет.

Рис. 3.

Метод тёмного поля в проходящем свете (рис.
4) применяется для получения изображений прозрачных неабсорбирующих объектов,
невидимых при освещении по методу светлого поля. Часто таковы биологич.
объекты. Свет от осветителя 7 и зеркала 2 направляется на препарат
конденсором спец. конструкции - т. н. конденсором тёмного поля 3. По
выходе из конденсора осн. часть лучей света, не изменившая своего направления
при прохождении через прозрачный препарат, образует пучок в виде полого
конуса и не попадает в объектив 5 (к-рый находится внутри этого
конуса). Изображение в М. создаётся лишь небольшой частью лучей, рассеянных
микрочастицами находящегося на предметном стекле 4 препарата внутрь
конуса и прошедшими через объектив. В поле зрения 6 на тёмном фоне
видны светлые изображения элементов структуры препарата, отличающихся от
окружающей среды показателем преломления. У крупных частиц видны только
светлые края, рассеивающие лучи света. При этом методе по виду изображения
нельзя определить, прозрачны частицы или непрозрачны, "больший или меньший
показатель преломления они имеют по сравнению с окружающей средой.

Рис. 4.

Метод ультрамикроскопии, основанный на
том же принципе (препараты в ультрамикроскопах освещаются перпендикулярно
направлению наблюдения), даёт возможность обнаружить (но не "наблюдать"
в буквальном смысле слова) чрезвычайно мелкие частицы, размеры которых
лежат далеко за пределами разрешающей способности наиболее сильных М. С
помощью иммерсионных ультрамикроскопов удаётся зарегистрировать присутствие
в препарате частиц размером до 2 • 10⁹ м. Однако определить
форму и точные размеры таких частиц с помощью этого метода невозможно:
их изображения представляются наблюдателю в виде дифракционных пятен, размеры
к-рых зависят не от размеров и формы самих частиц а от апертуры объектива
и увеличения М. Т. к. подобные частицы рассеивают очень мало света, то
для их освещения требуются чрезвычайно сильные источники света, напр, угольная
электрич. дуга. Ультрамикроскопы применяются гл. обр. в коллоидной химии.

При наблюдении по методу тёмного поля в
отражённом свете непрозрачные препараты (напр., шлифы металлов) освещают
сверху -через спец. кольцевую систему, расположенную вокруг объектива и
наз. э п и-конденсором.

Метод наблюдения в поляризованном свете
(поляризационная микроскопия) служит для микроскопич. исследования препаратов,
включающих оптически анизотропные элементы (или целиком состоящих из таких
элементов). К ним относятся мн. минералы, зёрна в шлифах сплавов, нек-рые
животные и растит, ткани и пр. Оптич. свойства анизотропных микрообъектов
различны в различных направлениях (см. Оптическая анизотропия) и
проявляются по-разному в зависимости от ориентации этих объектов относительно
направления наблюдения и плоскости поляризации света, падающего
на них. Наблюдение можно вести как в проходящем, так и в отражённом свете.
Свет, излучаемый осветителем, пропускают через поляризатор; сообщённая
ему при этом поляризация меняется при последующем прохождении света через
препарат (или отражении от него), и эти изменения изучаются с помощью анализатора
(см. Поляризационные приборы) и различных компенсаторов оптических.
По
таким изменениям можно судить об осн. оптич, характеристиках анизотропных
микрообъектов: силе двойного лучепреломления, количестве оптич.
осей и их ориентации, вращении плоскости поляризации, дихроизме.

Метод фазового контраста (и его разновидность
- т. н. метод "аноптрального" контраста) служит для получения изображений
прозрачных и бесцветных объектов, невидимых при наблюдении по методу светлого
поля. К числу таких объектов относятся, напр., живые неокрашенные животные
ткани. Метод основан на том, что даже при очень малых различиях в показателях
преломления разных элементов препарата световая волна, проходящая через
них, претерпевает разные изменения по фазе (приобретает т. н. фазовый рельеф).
Эти фазовые изменения, не воспринимаемые непосредственно ни глазом, ни
фотопластинкой, с помощью спец. оптич. устройства преобразуются в изменения
амплитуды световой волны, т. е. в изменения яркости ("амплитудный рельеф"),
к-рые уже различимы глазом или фиксируются на фоточувствит. слое. Др. словами,
в получаемом видимом изображении распределение яркостей (амплитуд) воспроизводит
фазовый рельеф. Такое изображение наз. фазово-контрастным. В типичной для
этого метода схеме (рис. 5) в переднем фокусе конденсора 3 устанавливается
апертурная диафрагма 2, отверстие к-рой имеет форму кольца. Её изображение
возникает вблизи заднего фокуса объектива 5, и там же устанавливается
т. н. фазовая пластинка 6, на поверхности к-рой имеется кольцевой
выступ или кольцевая канавка, наз. фазовым кольцом. Фазовая пластинка может
быть помещена и не в фокусе объектива (часто фазовое кольцо наносят прямо
на поверхность одной из линз объектива), но в любом случае неотклонённые
в препарате 4 лучи от осветителя f, дающие изображение диафрагмы
2,
должны полностью проходить через фазовое кольцо, к-рое значительно
ослабляет их (его делают поглощающим) и изменяет их фазу на лямбда/4 (лямбда
- длина волны света). В то же время лучи, даже ненамного отклонённые (рассеянные)
в препарате, проходят через фазовую пластинку, минуя фазовое кольцо (штриховые
линии), и не претерпевают дополнит, сдвига фазы. С учётом фазового сдвига
в материале препарата полная разность фаз между отклонёнными и неотклонёнными
лучами оказывается близкой к 0 или лямбда/2, и в результате интерференции
света в плоскости изображения 4' препарата 4 они заметно
усиливают или ослабляют друг друга, давая контрастное изображение структуры
препарата. Отклонённые лучи имеют значительно меньшую амплитуду по сравнению
с неотклонёнными, поэтому ослабление осн. пучка в фазовом кольце, сближая
значения амплитуд, также приводит к большей контрастности изображения.
Метод позволяет различать малые элементы структуры, чрезвычайно слабо контрастные
в методе светлого поля. Прозрачные частицы, сравнительно не малые по размерам,
рассеивают лучи света на столь небольшие углы, что эти лучи проходят вместе
с неотклонёнными через фазовое кольцо. Для подобных частиц азово-контрастный
эффект имеет место только вблизи их контуров, где происходит сильное рассеяние.

Рис. 5.

Метод интерференционного контраста (интерференционная
микроскопия) состоит в том, что каждый луч, входящий в М., раздваивается;
один из полученных лучей направляется сквозь наблюдаемую частицу, а второй
- мимо неё по той же или дополнит, оптич. ветви М. В окулярной части М.
оба луча вновь соединяются и интерферируют между собой. Результат интерференции
определяется разностью хода лучей 8, к-рая выражается формулой
8
= N * лямбда = = (пгде
п, ппоказатели преломления частицы и окружающей среды,
d - толщина частицы, N - т. н. порядок интерференции, лямбда
- длина волны света. Принципиальная схема одного из способов осуществления
интерференционного контраста показана на рис.
6. Конденсор 1и
объектив 4 снабжены двоя-копреломляющими пластинками (помечены на
рис. диагональными стрелками), первая из к-рых расщепляет исходный световой
луч на два луча, а вторая воссоединяет их. Один из лучей, проходя через
объект 3, запаздывает по фазе (приобретает разность хода по сравнению
со вторым лучом); величина этого запаздывания измеряется компенсатором
5. Метод интерференционного контраста в нек-рых отношениях сходен
с методом фазового контраста - оба они основаны на интерференции лучей,
прошедших через микрочастицу и миновавших её. Как и фазово-контрастная
микроскопия, этот метод позволяет наблюдать прозрачные и бесцветные объекты,
но их изображения могут быть и разноцветными (интерференционные цвета).
Оба метода пригодны для изучения живых тканей и клеток (и часто применяются
именно с этой целью). Отличие интерференционного метода от метода фазового
контраста заключается гл. обр. в возможности, используя компенсаторы, с
высокой точностью (до 1/300 лямбда) измерять разности хода, вносимые микрообъектами.
Это открывает широкие возможности количественных исследований - на основании
таких измерений могут быть рассчитаны общая масса и концентрация сухого
вещества в микрообъекте (напр., в растит. или животной клетке), показатель
преломления и размеры объекта (рис. 7). Метод интерференционного контраста
часто сочетают с др. методами микроскопии, в частности с наблюдением в
поляризованном свете; применение его совместно с микроскопией в ультрафиолетовых
лучах позволяет, напр., определить содержание
нуклеиновых кислот в
общей сухой массе объекта. К интерференционной микроскопии обычно относят
также методы использования микроинтерферометров.

Рис. 6.

Рис. 7. Микрофотография эритроцита человека
в монохроматическом свете с X = 0,546 мкм. Изгиб интерференционной
полосы воспроизводит в масштабе толщину эритроцита.

Метод исследования в свете люминесценции
(люминесцентная микроскопия, или флуоресцентная микроскопия) заключается
в наблюдении под М. зелено-оранжевого свечения микрообъектов, к-рое возникает
при их освещении сине-фиолетовым светом или не видимыми глазом ультрафиолетовыми
лучами (см. Люминесценция). При этом методе в оптич. схему М. вводятся
два светофильтра. Первый из них помещают перед конденсором; он пропускает
от источника-осветителя излучение только тех длин волн, к-рые возбуждают
люминесценцию либо самого объекта (собственная люминесценция), либо спец.
красителей, введённых в препарат и поглощённых его частицами (вторичная
люминесценция). Второй светофильтр, установленный после объектива, пропускает
к глазу наблюдателя (или на фоточувствительный слой) только свет люминесценции.
В люминесцентной микроскопии используют как освещение препаратов сверху
(через объектив, к-рый в этом случае служит и конденсором), так и снизу,
через обычный конденсор. Наблюдение при освещении сверху иногда наз. "люминесцентной
микроскопией в отражённом свете" (этот термин условен - возбуждение свечения
препарата не является простым отражением света); его часто сочетают с наблюдением
по фазово-контрастному методу в проходящем свете.

Метод широко применяется в микробиологии,
вирусологии, гистологии, цитологии, в пищ. пром-сти, при исследовании
почв, в микрохимическом анализе, в дефектоскопии. Обилие
и разнообразие применений связаны с чрезвычайно высокой цветовой чувствительностью
глаза и высокой контрастностью изображения самосветящегося объекта на тёмном
нелю-минесцирующем фоне, а также ценностью информации о составе и свойствах
исследуемых веществ, к-рую можно получить, зная интенсивность и спектральный
состав их люминесцентного излучения.

Метод наблюдения в ультрафиолетовых (У
Ф) л у-ч а х позволяет увеличить предельную разрешающую способность М.,
т. е. понизить его предельное разрешение, к-рое зависит (см. выше) от длины
волны лямбда применяемого излучения (для используемых в микроскопии УФ
лучей лямбда = 400 - 250 нм, тогда как для видимого света лямбда
= 700 - 400 нм). Но гл. обр. этот метод расширяет возможности микроскопич.
исследований за счёт того, что частицы мн. веществ, прозрачные в видимом
свете, сильно поглощают УФ излучение определённых длин волн и, следовательно,
легко различимы в УФ изображениях. Характерными спектрами поглощения в
УФ области обладает, напр., ряд веществ, содержащихся в растит, и животных
клетках (пуриновые основания, пиримидиновые основания, большинство
витаминов,
ароматич. аминокислоты, нек-рые липиды, тироксин
и др.);
это обусловило широкое применение УФ микроскопии в качестве одного из методов
цитохимического анализа.

Ультрафиолетовые лучи невидимы для человеческого
глаза. Поэтому изображения в УФ микроскопии регистрируют либо фотографически,
либо с помощью электроннооптического преобразователя или люминесцирующего
экрана. Распространён след, способ цветового представления таких изображений.
Препарат фотографируется в трёх длинах волн УФ области спектра; каждый
из полученных негативов освещается видимым светом определённого цвета (напр.,
синим, зелёным и красным), и все они одновременно проектируются на один
экран. В результате на экране создаётся цветное изображение объекта в условных
цветах, зависящих от поглощающей способности препарата в ультрафиолете.

Метод наблюдения в инфракрасных (И К) лучах
также требует преобразования невидимого для глаза изображения в видимое
путём его фотографирования или с помощью электроннооптич. преобразователя.
ИК микроскопия позволяет изучать внутр. структуру объектов, непрозрачных
в видимом свете, напр, тёмных стекол, нек-рых кристаллов и минералов и
пр,