МИКРОСКОПИЧЕСКАЯ ТЕХНИКА
в биологии,
совокупность методов и приёмов для изучения с помощью оптич. и электронного
микроскопов строения, жизнедеятельности, развития, химич. состава и физич.
свойств клеток, тканей и органов. М. т. включает: подготовку живых объектов
к микроскопич. исследованию и его проведение, изготовление постоянных (неживых)
препаратов; микро-, гисто- и цитохимич. исследования; особые методы подготовки
препаратов для электронной микроскопии.
Прижизненные наблюдения в проходящем свете
осуществляются на простейших, мелких яйцах, культивируемых клетках и тканях,
прозрачных участках тела многоклеточных (напр., на кровеносных сосудах
в плавательной перепонке лягушки). В отражённом свете под микроскопом можно
изучать поверхностные структуры клетки, ткани, органа. Для цитофизиологиче-ских
наблюдений пользуются прижизненным окрашиванием, дающим представление
о рН клетки и её органоидов, а также о физиологич. состоянии живого объекта.
Для прижизненных наблюдений требуются: нагревательный столик (рис. 1) -
особый термостат, перестраиваемый на заданную темп-ру в широком температурном
диапазоне; стеклянные, пластмассовые, кварцевые, металлич. или др. камеры
(рис. 2) с постоянной или проточной средой требуемого состава. Наблюдаемые
объекты (чаще клетки однослойных культур) могут длит, время оставаться
нормальными при достаточном снабжении их питат. веществами и кислородом.
Одна из задач М. т. для живых объектов - повышение контрастности изображения,
для чего используется, например, фазово-контрастное устройство. Интерференционная
микроскопия дополнительно даёт сведения о толщине объекта, концентрации
в нём сухого вещества, содержании воды и показателе преломления. Прижизненные
наблюдения проводятся также в тёмном поле (ультрамикроскопия) с использованием
спец. конденсора; при этом объект освещается сбоку, а фон остаётся тёмным.
Темнопольное устройство позволяет увидеть чрезвычайно мелкие (напр., коллоидные)
частицы. С помощью поляризационного микроскопа можно изучать объекты (или
их элементы), обладающие оптической анизотропией. Для исследования
как живых, так и неживых биологических объектов применяется люминесцентная
микроскопия, особенно для изучения вторичной флуоресценции, возникающей
при окраске клеток и тканей слабыми концентрациями флуоро-хромов (акридиновый
оранжевый, эри-трозин, родамин и др.). Различия во флуоресценции отдельных
химических веществ (нуклеиновых к-т, липидов) позволяют изучать их локализацию,
динамику изменений и даже количество изучаемого вещества. Соединение белка
с флуо-рохромом (изоцианат флуоресцеина) и связывание этого вещества с
антителами
(см. Иммунофлуоресценция) даёт возможность выяснить локализацию
антигенов, судьбу антител и др. вопросы иммунологии. Недавно получил
распространение метод микроскопии живых и неживых объектов в ультрафиолетовых
лучах с использованием специальной кварцевой оптики. Наблюдения над живыми
объектами документируются микрокиносъёмкой, особенно замедленной.
Рис. 1. Нагревательный столик на микроскопе.
Рис. 2. Камера для культивирования клеток
и прижизненных наблюдений за их ростом и развитием: / - камера в собранном
виде; 2 - камера в разобранном виде: а - верхняя стальная пластина;
б
- резиновая прокладка: в покровное стекло; г - средняя
секция; д - нижняя стальная пластина; 3 - часть средней секции снизу:
е
- каналы; ж - резервуары .
Для получения постоянных препаратов объект
фиксируют, т. е. убивают так, чтобы он сохранил по возможности неизменной
структуру. Наиболее распространённые фиксаторы - формалин, спирт, четырёхокись
осмия, а также комбинированные фиксаторы - смеси веществ. Фиксация (особенно
для электронной микроскопии) осуществляется также методом лиофилизации,
высушиванием
мазков (напр., крови) или отпечатков. При работе с клеточными культурами
используются пластинки из стекла или слюды, на к-рых клетки располагаются
в один слой. В др. случаях для микроскопии пользуются срезами, получаемыми
на микротоме, объект при этом обезвоживают и заливают в парафин,
целлоидин, желатину или замораживают. Для электронной микроскопии материал
обычно фиксируют четырёхокисью осмия, а заливку производят в акриловые
мономеры, к-рые полимеризуют соответствующим катализатором, или в эпоксидные
смолы.
Микро-, гисто-и цитохи-мич. исследования.
Для повышения контрастности препаратов, наблюдаемых в оптич. микроскоп,
применяют красители, избирательно окрашивающие разные клеточные структуры.
Особенно широко используются красители в гисто-химии. Гистохимич.
реакции основаны на образовании нек-рыми веществами нерастворимых и иногда
окрашенных осадков, обнаруживаемых микроскопически. Ферменты обнаруживаются
в клетках по активности при их воздействии на определённые субстраты, находящиеся
в ткани или добавленные извне. Интенсивность гистохимич. реакций часто
изучают и оценивают визуально. Более совершенны колич. методы оценки, напр,
подсчёт числа клеток с определённой интенсивностью окраски, числа зёрен
осадка, а также авторадиография, ци-тофотометрия.
При электронной микроскопии вирусов, микроорганизмов,
ультратонких срезов более крупных объектов их контрастность усиливают напылением
частиц металла. Для негативного контраста объект помещают в раствор более
плотного вещества (напр., фосфор-но-вольфрамовой к-ты), заполняющего промежутки
между изучаемыми частицами, к-рые выглядят светлыми на тёмном фоне. Контраст
усиливают также, применяя "электронные красители" (четырёхокись осмия,
уранил и др.), избирательно связывающиеся с нек-рыми участками объекта.
При использовании ферритина зёрна его, содержащие молекулы железа, обнаруживаются
в составе клеточных структур. См. также Микроскоп.
Лит.: М е и с е л ь М. Н., Люминесцентная
микроскопия, "Вестник АН СССР", 1953, МЬ 10, с. 3 - 10; Р о м е и с Б.,
Микроскопическая техника, пер. с нем., М., 1954; Брумберг Е. М., О флуоресцентных
микроскопах, "Журнал общей биологии", 1955, т. 16, № 3, с. 222 - 37; Современные
методы и техника морфологических исследований. [Сб. ст.], под ред. Д. А.
Жданова, Л., 1955; Р о с к и н Г. И., Л е в и н с о н Л. Б., Микроскопическая
техника, 3 изд., М., 1957; Аппельт Г., Введение в методы микроскопического
исследования, пер. с нем., М., 1959; Зубжицкий Ю. Н., Метод люминесцентной
микроскопии в микробиологии, вирусологии и иммунологии, Л., 1964.
С. Я. Залкинд.
А Б В Г Д Е Ё Ж З И Й К Л М Н О П Р С Т У Ф Х Ц Ч Ш Щ Ъ Ы Ь Э Ю Я